Postoje mnogi izazovi kod cjepiva Pfizer-BioNTech i Moderna

Postoje studije koje izvješćuju o štetnim učincima opaženim u drugim vrstama cjepiva

Razvijeno je nekoliko cjepiva za COVID-19, s posebnim naglaskom na mRNK cjepiva (Pfizer-BioNTech i Moderna), replikacijsko-neispravna rekombinantna adenoviralna vektorska cjepiva (Janssen-Johnson i Johnson, Astra-Zeneca, Sputnik-V i CanSino) te inaktivirana cjepiva (Sinopharm, Bharat Biotech i Sinovac). MRNK cjepivo ima prednosti fleksibilnosti i učinkovitosti u dizajnu i proizvodnji imunogena, a trenutno su brojni kandidati za cjepivo u različitim fazama razvoja i primjene. Konkretno, cjepivo protiv COVID-19 mRNK BNT162b2 koje su razvili Pfizer i BioNTech ocijenjeno je u uspješnim kliničkim ispitivanjima [2,3,4] i primijenjeno u nacionalnim kampanjama cijepljenja protiv COVID-19 u različitim regijama širom svijeta.[5,6,7,8]

BNT162b2 je lipidna nanočestica (LNP) -enkapsulirana, nukleozidno modificirano RNA cjepivo (modRNK) i kodira cjelodnevni sars-CoV-2 spike (S) protein, modificiran dvjema proline mutacijama kako bi se osigurala antigenski optimalna pre-fuzijska konformacija, koja oponaša netaknuti virus kako bi izazvala antitijela koja neutraliziraju virus.[3] U skladu s randomiziranim kliničkim ispitivanjima, BNT162b2 pokazao je visoku učinkovitost u širokom rasponu ishoda povezanih s COVID-19 u stvarnom okruženju.[5] Ipak, i dalje postoje mnogi izazovi, uključujući praćenje dugoročne sigurnosti i djelotvornosti cjepiva. To zahtijeva daljnju evaluaciju i istrage. Sigurnosni profil BNT162b2 trenutno je dostupan samo u kratkoročnim kliničkim ispitivanjima. Prijavljeni su manje česti štetni učinci BNT162b2, uključujući perikarditis, aritmiju, duboku vensku trombozu, plućnu emboliju, infarkt miokarda, intrakranijalno krvarenje i trombocitopeniju[4,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20]. Postoje i studije koje izvješćuju o štetnim učincima opaženim u drugim vrstama cjepiva.[21,22,23,24] Kako bi se bolje razumjeli mehanizmi na kojima se temelje štetni učinci povezani s cjepivom, potrebna su klinička istraživanja te stanične i molekularne analize.

Nedavna studija pokazala je da se SARS-CoV-2 RNK može prepisati i integrirati u genom ljudskih stanica.[25] To dovodi do pitanja može li se to dogoditi i s BNT162b2, koji kodira djelomični SARS-CoV-2 RNK U podacima farmakokinetike koje je Pfizer dostavio Europskoj agenciji za lijekove (EMA), BNT162b2 biodistribucija ispitivana je na miševima i štakorima intra-mišićnom injekcijom s radiolabeliranim LNP-om i luciferazom modRNA. Radioaktivnost je otkrivena u većini tkiva od prve vremenske točke (0,25 h), a rezultati su pokazali da su mjesto ubrizgavanja i jetra glavna mjesta distribucije, a maksimalne koncentracije opažene su na 8–48 h nakon doze.[26] Nadalje, u životinja koje su primile injekciju BNT162b2 uočeni su reverzibilni učinci jetre, uključujući povećanu jetru, vakuolaciju, povećanu razinu gama glutamil transferaze (γGT) i povećane razine aspartatne transaminaze (AST) i alkalne fosfataze (ALP).[26] Prolazni učinci jetre uzrokovani LNP sustavima isporuke prethodno su prijavljeni [27,28,29,30], međutim, međutim, također je dokazano da prazan LNP bez samo modRNA-e ne uvodi značajnu ozljedu jetre.[27] Stoga, u ovoj studiji, cilj nam je ispitati učinak BNT162b2 na liniju ljudskih stanica jetre in vitro i istražiti može li se BNT162b2 preokrenuti transkribirati u DNA putem endogenih mehanizama.

Materijali i metode

Kultura stanica

Stanice huh7 (JCRB Cell Bank, Osaka, Japan) kultivirane su u 37 °C pri 5% CO² s DMEM medijem (HyClone, HYCLSH30243.01) dopunjenim s 10% (v/v) fetalnim goveđim serumom (Sigma-Aldrich, F7524-500ML, Burlington, MA, SAD) i 1% (v/v) Penicilin-Streptomicin (HyClone, SV30010, Logan, UT, SAD). Za liječenje BNT162b2, Huh7 stanice su zasijane gustoćom od 200.000 stanica / bunara u pločama od 24 bušotine. Cjepivo protiv BNT162b2 mRNK (Pfizer BioNTech, New York, NY, SAD) razrijeđeno je sterilnom injekcijom natrijevog klorida od 0,9%, USP u konačnu koncentraciju od 100 μg/mL kako je opisano u smjernicama proizvođača.[31] Suspenzija BNT162b2 zatim je dodana u medije stanične kulture kako bi se postigle konačne koncentracije od 0,5, 1,0 ili 2,0 μg/mL. Huh7 stanice su inkubirane sa ili bez BNT162b2 za 6, 24 i 48 h. Stanice su temeljito oprane PBS-om i ubrane tripsinizacijom i pohranjene u −80 °C do daljnje uporabe.

RT-QPCR U STVARNOM VREMENU

RNK iz stanica izvađena je RNeasy Plus Mini Kitom (Qiagen, 74134, Hilden, Njemačka) prema protokolu proizvođača. RT-PCR je izveden pomoću RevertAid First Strand cDNA Synthesis kompleta (Thermo Fisher Scientific, K1622, Waltham, MA, SAD) prema protokolu proizvođača. QPCR u stvarnom vremenu izveden je pomoću Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, K0222, Waltham, MA, SAD) s temeljnim premazima za BNT162b2, LINE-1 i kućne gene ACTB i GAPDH (tablica 1).

Bojenje imunofluorescencije i konfokalno snimanje

Huh7 stanice su kultivirane u osmerokomornim toboganima (LAB-TEK, 154534, Santa Cruz, CA, SAD) gustoće 40.000 stanica/bunara, sa ili bez BNT162b2 (0,5, 1 ili 2 μg/mL) za 6 h. Imunohistokemija je provedena pomoću primarnog antitijela anti-LINE-1 ORF1p monoklonsko protutijelo miša (Merck, 3574308, Kenilworth, NJ, SAD), sekundarnog antitijela Cy3 Donkey anti-miš (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, SAD) i Hoechst (Life technologies, 34850, Carlsbad, CA, SAD), slijedeći protokol Thermo Fisher (Waltham, MA, SAD). Dvije slike po stanju snimljene su pomoću Zeiss LSM 800 i cilja uranjanja ulja 63X, a intenzitet bojenja kvantificiran je na cijelom pojedinom području stanica i području jezgre na 15 stanica po slici od strane ImageJ 1.53c. INTENZITET bojenja LINE-1 za citosol izračunat je oduzimanjem intenziteta jezgre od intenziteta cijele stanice. Svim slikama stanica dodijeljen je slučajni broj kako bi se spriječila pristranost. Za označavanje jezgri (određenih Hoechstovim bojenjem) i cijelih stanica (određenih granicama fluorescencije LINE-1) korišten je freehand alat za odabir. Ta su područja tada izmjerena, a srednji intenzitet korišten je za usporedbu skupina.

Pročišćavanje genomske DNK, pojačanje PCR-a, pročišćavanje Agarose gela i sekvenciranje Sangera

Genomska DNK izvađena je iz staničnih kuglica s PBND puferom (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,45% NP-40, 0,45% Tween-20) prema prethodno opisanom protokolu [32]. Kako bi se uklonila preostala RRNA iz pripravka DNK, RNase (100 μg/mL, Qiagen, Hilden, Njemačka) dodan je u pripremu DNK i inkubiran na 37 °C za 3 sata, nakon čega slijedi 5 minuta na 95°C. PCR je zatim izveden pomoću temeljnih premaza koji ciljaju BNT162b2 (sekvencije su prikazane u tablici 1.), sa sljedećim programom: 5 min na 95 °C, 35 ciklusa od 95 °C za 30 s, 58 °C za 30 s i 72 °C tijekom 1 minute; konačno, 72 °C za 5 minuta i 12 °C za 5 min. PCR proizvodi su se izvodili na 1,4% (w/v) gelu od agaroza. Izrezane su trake koje odgovaraju amplikonima očekivane veličine (444 bps), a DNA je izvađena pomoću QIAquick PCR purifikacijskog kompleta (Qiagen, 28104, Hilden, Njemačka), slijedeći upute proizvođača. Slijed DNK pojačala potvrđen je Sangerovim sekvenciranjem (Eurofins Genomics, Ebersberg, Njemačka).

Statistika

Statističke usporedbe provedene su pomoću dvokrakog Studentovog t-testa i ANOVA-e. Podaci se izražavaju kao srednja vrijednost ± SEM ili ± SD. Razlike s p < 0,05 smatraju se značajnima.

Etičke izjave

Linija stanica Huh7 dobivena je iz japanske zbirke istraživačkih bioresources (JCRB) Cell Bank.

Rezultati

BNT162b2 ulazi u liniju ljudskih stanica jetre Huh7 stanice pri visokoj učinkovitosti

Da bismo utvrdili ulazi li BNT162b2 u ljudske stanice jetre, izložili smo liniju stanica ljudske jetre Huh7 BNT162b2. U prethodnoj studiji o kinetici apsorpcije LNP isporuke u Huh7 stanicama, maksimalna biološka djelotvornost LNP-a opažena je između 4 i 7 h.[33] Stoga su u našoj studiji huh7 stanice kultivirane sa ili bez povećanja koncentracija BNT162b2 (0,5, 1,0 i 2,0 μg/mL) za 6, 24 i 48 h. RNK je izvađena iz stanica i u stvarnom vremenu kvantitativna lančana reakcija polimeraze reverzne transkripcije (RT-qPCR) izvedena je pomoću prajmera koji ciljaju sekvencu BNT162b2. Cijeli slijed BNT162b2 javno je dostupan.[34] i sadrži gornju granicu od dva nukleotida; 5′- neprevedena regija (UTR) koja uključuje 5′ -UTR ljudskog gena α globina; punoljetni sars-CoV-2 S protein s dvije prolinske mutacije; 3′-UTR koji uključuje ljudski mitohondrijski segment 12S rRNK (mtRNR1) i ljudski segment gena AES/TLE5 s dvije mutacije C→U; poli(A) rep. Detaljna analiza S proteinske sekvence u BNT162b2 otkrila je 124 sekvence koje su 100 % identične ljudskim genomskim sekvencama i tri sekvence sa samo jednom nukleotidnom (nt) neusklađenošću u 19-26 nts (Tablica S1, vidi Dopunski materijali). Da bismo otkrili razinu RNA BNT162b2, dizajnirali smo temeljne premaze s prednjim temeljnim premazom smještenim u proteinskim regijama SARS-CoV-2 S i obrnutim temeljnim premazom u 3′-UTR, što omogućuje otkrivanje PCR pojačala jedinstvenog za BNT162b2 bez nespecifičnog vezanja temeljnih premaza na ljudske genomske regije.

PCR temeljni set koji se koristi za otkrivanje mRNA razine i obrnutog transkripcije BNT162b2. Slika BNT162b2 prilagođena je iz prethodno opisane literature.[34]

Rezultati RT-qPCR-a pokazali su da su Huh7 stanice liječene BNT162b2 imale visoke razine BNT162b2 mRNA u odnosu na gene za održavanje u dobi od 6, 24 i 48 h. Tri koncentracije BNT162b2 dovele su do sličnih intracelularnih razina BNT162b2 mRNK u različitim vremenskim točkama, osim što je značajna razlika između 1,0 i 2,0 μg/mL opažena pri 48 h. Razine BNT162b2 mRNK značajno su smanjene na 24 h u odnosu na 6 h, ali su se ponovno povećale na 48 h.

Razine BNT162b2 mRNA u Huh7 stanicama tretiranim BNT162b2. Huh7 stanice tretirane su bez (Ctrl) ili s 0,5 (V1), 1 (V2) i 2 μg/mL (V3) BNT162b2 za 6 (zelene točkice), 24 (narančaste točkice) i 48 h (plave točkice). RNA je pročišćena i qPCR je izveden pomoću temeljnih premaza koji ciljaju BNT162b2. Razine RNK BNT162b2 prikazane su kao evidentirane 2^−ΔΔCT vrijednosti u odnosu na gene za čuvanje kuća GAPDH i ACTB. Rezultati su iz pet neovisnih eksperimenata (n = 5). Razlike između odgovarajućih skupina analizirane su pomoću studentovog t-testa s dva kraka. Podaci se izražavaju kao srednja vrijednost ± SEM. (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 u odnosu na odgovarajuću kontrolu u svakoj vremenskoj točki ili kako je naznačeno).

Reference:

1. Svjetska zdravstvena organizacija. Nadzorna ploča s koronavirusom (COVID-19). Dostupno na internetu: https://covid19.who.int/(pristupljeno 22. veljače 2022.).
2. Mulligan, M.J.; Lyke, K.E.; Kitchin, N.; Absalon, J.; Gurtman, A.; Lockhart, S.; Neuzil, K.; Raabe, V.; Bailey, R.; Swanson, K.A.; i sur. Ispitivanje faze I/II cjepiva protiv COVID-19 RNK BNT162b1 u odraslih. Priroda2020,586, 589–593. [Google scholar] [CrossRef] [PubMed]
3. Walsh, E.E.; Frenck, R.W., Mlađi; Falsey, A.R.; Kitchin, N.; Absalon, J.; Gurtman, A.; Lockhart, S.; Neuzil, K.; Mulligan, M.J.; Bailey, R.; i sur. Sigurnost i imunogenost dvaju kandidata za cjepivo protiv COVID-19 koji se temelje na RNK.  Engl. J. Med.2020., 383., 2439.–2450. [Google scholar] [CrossRef] [PubMed]
4. Polack, F.P.; Thomas, S.J.; Kitchin, N.; Absalon, J.; Gurtman, A.; Lockhart, S.; Perez, J.L.; Perez Marc, G.; Moreira, E.D.; Zerbini, C.; i sur. Sigurnost i djelotvornost cjepiva BNT162b2 mRNA COVID-19.  Engl. J. Med.2020., 383., 2603.–2615. [Google scholar] [CrossRef] [PubMed]
5. Harris, R.J.; Hall, J.A.; Zaidi, A.; Andrews, N.J.; Dunbar, J.K.; Dabrera, G. Učinak cijepljenja na prijenos SARS-CoV-2 u kućanstvu u Engleskoj.  Engl. J. Med.2021., 385., 759.–760. [Google scholar] [CrossRef]
6. Butt, A.A.; Omer, S.B.; Yan, P.; Shaikh, O.S.; Mayr, F.B. Sars-CoV-2 učinkovitost cjepiva u visokorizičnoj nacionalnoj populaciji u stvarnom okruženju.  Pripravnica. Med.2021., 174., 1404.–1408. [Google scholar] [CrossRef]
7. Dagan, N.; Barda, N.; Kepten, E.; Miron, O.; Perchik, S.; Katz, M.A.; Hernan, M.A.; Lipsitch, M.; Reis, B.; Balicer, R.D. BNT162b2 mRNA Cjepivo protiv Covida-19 u okruženju masovnog cijepljenja diljem zemlje.  Engl. J. Med.2021., 384., 1412.–1423. [Google scholar] [CrossRef]
8. Rossman, H.; Shilo, S.; Meir, T.; Gorfine, M.; Shalit, U.; Segal, E. COVID-19 dinamika nakon nacionalnog programa imunizacije u Izraelu.  Med.2021., 27., 1055.–1061. [Google scholar] [CrossRef]
9. Ventilator, B.E.; Shen, J.Y.; Lim, X.R.; Tu, T.M.; Chang, C.C.R.; Khin, H.S.W.; Koh, J.S.; Rao, J.P.; Lau, S.L.; Tan, G.B.; i sur. Cerebralna venska tromboza nakon cijepljenja protiv BNT162b2 mRNA SARS-CoV-2: Događaj crnog labuda. Ja sam J. Hematol., 96., E357–E361. [Google scholar] [CrossRef]
10. Larson, K.F.; Ammirati, E.; Adler, E.D.; Cooper, L.T., mlađi; Hong, K.N.; Saponara, G.; Couri, D.; Cereda, A.; Procopio, A.; Cavalotti, C.; i sur. Miokarditis Nakon cijepljenja BNT162b2 i mRNA-1273. Cirkulacija2021, 144, 506–508. [Google scholar] [CrossRef]
11. Menni, C.; Klasar, K.; Svibanj, A.; Polidori, L.; Capdevila, J.; Louca, P.; Sudre, C.H.; Nguyen, L.H.; Drew, D.A.; Merino, J.; i sur. Nuspojave cjepiva i infekcija SARS-CoV-2 nakon cijepljenja kod korisnika aplikacije COVID Symptoms Study u Velikoj Britaniji: Buduća opservacijska studija. Lancet Infect. Dis.2021., 21., 939.–949. [Google scholar] [CrossRef]
12. Hansen, T.; Titze, U.; Kulamadayil-Heidenreich, N.S.A.; Glombitza, S.; Tebbe, J.J.; Rocken, C.; Schulz, B.; Weise, M.; Wilkens, L. Prvi slučaj obdukcijskog ispitivanja u bolesnika cijepljenog protiv SARS-CoV-2.  J. Infect. Dis.2021., 107., 172.–175. [Google scholar] [CrossRef] [PubMed]
13. Kadali, R.A.K.; Janagama, R.; Peruru, S.; Malayala, S.V. Nuspojave cjepiva BNT162b2 mRNA COVID-19: Randomizirana, presječna studija s detaljnim samoprocjenom simptoma zdravstvenih radnika.  J. Infect. Dis.2021., 106., 376.–381. [Google scholar] [CrossRef] [PubMed]
14. Parkash, O.; Sharko, A.; Farooqi, A.; Ying, G.W.; Sura, P. Akutni pankreatitis: Moguća nuspojava cjepiva protiv COVID-19. Cureus2021, 13, e14741. [Google scholar] [CrossRef] [PubMed]
15. Mazzatenta, C.; Piccolo, V.; Tempo, G.; Romano, ja.; Argenziano, G.; Bassi, A. Purpuric lezije na kapcima razvijene nakon cjepiva BNT162b2 mRNA COVID-19: Još jedan komad SARS-CoV-2 kožne slagalice?  Acad. Dermatol. Venereol.2021., 35., e543– e545. [Google scholar] [CrossRef]
16. Lee, E.J.; Cines, D.B.; Gernsheimer, T.; Kessler, C.; Michel, M.; Tarantino, dr.med.; Semple, J.W.; Arnold, D.M.; Godeau, B.; Lambert, M.P.; i sur. Trombocitopenija nakon cijepljenja Pfizer i Moderna SARS-CoV-2. Ja sam J. Hematol.2021., 96., 534.–537. [Google scholar] [CrossRef]
17. Ishay, Y.; Kenig, A.; Tsemach-Toren, T.; Amer, R.; Rubin, L.; Hershkovitz, Y.; Kharouf, F. Autoimuni fenomeni nakon cijepljenja protiv SARS-CoV-2. 2021., 99., 107970. [Google scholar] [CrossRef]
18. Das, B.B.; Kohli, Sjedinjene Američke Države; Ramachandran, P.; Nguyen, H.H.; Greil, G.; Hussain, T.; Tandon, A.; Kane, C.; Avula, S.; Duru, C.; i sur. Mioperikarditis nakon mRNA COVID-19 Cijepljenje u adolescenata u dobi od 12 do 18 godina.  Pediatr.2021., 238., 26.–32.e1. [Google scholar] [CrossRef]
19. McLaurin-Jiang, S.; Garner, C.D.; Krutsch, K.; Hale, T.W. Simptomi majke i djeteta nakon cijepljenja protiv COVID-19 među majkama koje doje.  Med.2021., 16., 702.–709. [Google scholar] [CrossRef]
20. Barda, N.; Dagan, N.; Ben-Shlomo, Y.; Kepten, E.; Waxman, J.; Ohana, R.; Hernan, M.A.; Lipsitch, M.; Kohane, I.; Netzer, D.; i sur. Sigurnost cjepiva BNT162b2 mRNA Covid-19 u nacionalnom okruženju.  Engl. J. Med.2021., 385., 1078.–1090. [Google scholar] [CrossRef]
21. Baden, L.R.; El Sahly, H.M.; Essink, B.; Kotloff, K.; Frey, S.; Novak, R.; Diemert, D.; Spector, S.A.; Rouphael, N.; Creech, C.B.; i sur. Djelotvornost i sigurnost cjepiva protiv mRNA-1273 SARS-CoV-2.  Engl. J. Med.2021., 384., 403.–416. [Google scholar] [CrossRef]
22. Sadoff, J.; Siva, G.; Vandebosch, A.; Cardenas, V.; Shukarev, G.; Grinsztejn, B.; Goepfert, P.A.; Truyers, C.; Fennema, H.; Špijuni, B.; i sur. Sigurnost i djelotvornost jednodoznog cjepiva Ad26.COV2.S protiv Covida-19.  Engl. J. Med.2021., 384., 2187.–2201. [Google scholar] [CrossRef] [PubMed]
23. Eichinger, S.; Warkentin, T.E.; Greinacher, A. Trombotička trombocitopenija nakon cijepljenja ChAdOx1 nCoV-19. Odgovor.  Engl. J. Med.2021., 385., e11. [Google scholar] [CrossRef] [PubMed]
24. Doroftei, B.; Ciobica, A.; Ilie, O.D.; Maftei, R.; Ilea, C. Mini-pregled koji raspravlja o pouzdanosti i učinkovitosti cjepiva protiv COVID-19. Dijagnostika2021, 11, 579. [Google scholar] [CrossRef]
25. Zhang, L.; Richards, A.; Barrasa, M.I.; Hughes, S.H.; Mladi, R.A.; Jaenisch, R. Obrnuto-transkribirani SARS-CoV-2 RNA može se integrirati u genom kultiviranih ljudskih stanica i može se izraziti u tkivima dobivenim od pacijenta.  Natl. Acad. Sci. USA2021, 118, e2105968118. [Google scholar] [CrossRef] [PubMed]
26. Dostupno na internetu: https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/comirnaty-epar-public-assessment-report_en.pdf(pristupljeno 24. veljače 2022.).
27. Tanaka, H.; Takata, N.; Sakurai, Y.; Yoshida, T.; Inoue, T.; Tamagawa, S.; Nakai, Y.; Tange, K.; Yoshioka, H.; Maeki, M.; i sur. Isporuka Oligonukleotida pomoću samorazgradivog lipidnog materijala. Farmaceutika2021, 13, 544. [Google scholar] [CrossRef]
28. Sedić, M.; Senn, J.J.; Lynn, A.; Laska, M.; Smith, M.; Platz, S.J.; Bolen, J.; Hoge, S.; Bulychev, A.; Jacquinet, E.; i sur. Procjena sigurnosti lipidne nanočestica formulirane modificirane mRNA u Sprague-Dawley Rat i Cynomolgus Monkey. Veterinar Pathol., 55., 341.–354. [Google scholar] [CrossRef]
29. Sato, Y.; Matsui, H.; Yamamoto, N.; Sato, R.; Munakata, T.; Kohara, M.; Harashima, H. Vrlo specifična isporuka siRNA-e hepatocitima zaobilazi endotelnu staničnu toksičnost povezanu s lipidnim nanočesticama koja dovodi do sigurnog i učinkovitog smanjenja virusa hepatitisa B.  Kontrola. Izdanje2017, 266, 216–225. [Google scholar] [CrossRef]
30. Heidel, J.D.; Yu, Z.; Liu, J.Y.; Rele, S.M.; Liang, Y.; Zeidan, R.K.; Kornbrust, D.J.; Davis, M.E. Administracija u neljudskim primatima eskalacije intravenskih doza ciljanih nanočestica koje sadrže ribonukleotid reduktazu podjedinica M2 siRNA.  Natl. Acad. Sci. USA2007, 104, 5715–5721. [Google scholar] [CrossRef]
31. Dostupno na internetu: https://www.cvdvaccine-us.com/(pristupljeno 24. veljače 2022.).
32. Dostupno na internetu: http://bridgeslab.sph.umich.edu/protocols/index.php/Preparation_of_Tail_Samples_(for_Genotyping)(pristupljeno 24. veljače 2022.).
33. Gallud, A.; Munson, M.J.; Liu, K.; Idstrom, A.; Barriga, H.M.; Tabaei, S.; Aliakbarinodehi, N.; Ojansivu, dr.; Lubart, Q.; Doutch, J.J.; i sur. Vremenska evolucija prolijevanja PEG-a i krunidbe proteina u serumu određuje kinetiku unosa stanica i isporuku lipidnih nanočestica. bioRxiv2021. [Google scholar] [CrossRef]
34. Svjetska zdravstvena organizacija Messenger RNA kodiranje cjelovečernje SARS-CoV-2 Spike glikoprotein. 2020. Dostupno na internetu: https://web.archive.org/web/20210105162941/https://mednet-communities.net/inn/db/media/docs/11889.doc(pristupljeno 24. veljače 2022.).
35. Mita, P.; Wudzinska, A.; Sunce, X.; Andrade, J.; Nayak, S.; Kahler, D.J.; Badri, S.; LaCava, J.; Ueberheide, B.; Yun, C.Y.; i sur. LOKALIZACIJA proteina LINE-1 i funkcionalna dinamika tijekom staničnog ciklusa. Elife2018, 7, e30058. [Google scholar] [CrossRef]
36. Sato, Y.; Kinami, Y.; Hashiba, K.; Harashima, H. Različite kinetike za unos jetre lipidnih nanočestica između apolipoproteina E/ lipoprotein receptora niske gustoće i N-acetil-d-galaktozamin / asialoglycoprotein receptora put.  Kontrola. Izdanje2020, 322, 217–226. [Google scholar] [CrossRef]
37. Vogel, A.B.; Kanevsky, I.; Che, Y.; Swanson, K.A.; Muik, A.; Vormehr, M.; Kranz, L.M.; Walzer, K.C.; Hein, S.; Guler, A.; i sur. Cjepiva BNT162b štite resus makakije od SARS-CoV-2. Priroda2021, 592, 283–289. [Google scholar] [CrossRef] [PubMed]
38. Bahl, K.; Senn, J.J.; Yuzhakov, O.; Bulychev, A.; Brito, L.A.; Hassett, K.J.; Laska, M.E.; Smith, M.; Almarsson, O.; Thompson, J.; i sur. Pretklinička i klinička demonstracija imunogenosti mRNA cjepivima protiv virusa gripe H10N8 i H7N9.  Ther.2017., 25., 1316.–1327. [Google scholar] [CrossRef] [PubMed]
39. Bril, F.; Al Diffalha, S.; Dean, M.; Fettig, D.M. Autoimuni hepatitis koji se razvija nakon cjepiva protiv bolesti koronavirusa 2019(COVID-19): Uzročnost ili žrtva?  Hepatol.2021., 75., 222.–224. [Google scholar] [CrossRef]
40. Kazazian, H.H., mlađi; Moran, J.V. Mobilni DNK u zdravlju i bolesti.  Engl. J. Med.2017., 377., 361.–370. [Google scholar] [CrossRef] [PubMed]
41. Coffin, J.M.; Fan, H. Otkriće obrnutog transkriptaze.  Velečasni Virol.2016,3, 29–51. [Google scholar] [CrossRef]
42. Lander, E.S.; Linton, L.M.; Birren, B.; Nusbaum, C.; Zody, M.C.; Baldwin, J.; Devon, K.; Dewar, K.; Doyle, M.; FitzHugh, W.; i sur. Početno sekvenciranje i analiza ljudskog genoma. Priroda2001, 409, 860–921. [Google scholar] [CrossRef]
43. Ostertag, E.M.; Goodier, J.L.; Zhang, Y.; Kazazian, H.H., Jr. SVA elementi su neautonomni retrotranspozoni koji uzrokuju bolesti kod ljudi.  Hum. Genet.2003., 73., 1444.–1451. [Google scholar] [CrossRef]
44. Hancks, D.C.; Kazazian, H.H., Jr. Aktivni ljudski retrotranspozoni: varijacije i bolesti.  Opin. Genet. Dev.2012., 22., 191.–203. [Google scholar] [CrossRef]
45. Jones, R.B.; Pjesma, H.; Xu, Y.; Garnizon, K.E.; Buzdin, A.A.; Anwar, N.; Hunter, D.V.; Mujib, S.; Mihajlović, V.; Martin, E.; i sur. LINE-1 retrotransponabilni element DNA se nakuplja u stanicama zaraženim HIV-1.  Virol.2013., 87., 13307.–13320. [Google scholar] [CrossRef]
46. Macchietto, M.G.; Langlois, R.A.; Shen, S.S. Virus-inducirani transponabilni element izraziti up-regulaciju u ljudskim i mišjim stanicama domaćina. Life Sci. Alliance2020, 3, e201900536. [Google scholar] [CrossRef] [PubMed]
47. Yin, Y.; Liu, X.Z.; On, X.; Zhou, L.Q. Egzogeni koronavirus komunicira s endogenim retrotranspozonom u ljudskim stanicama.  Infekcija ćelije. Mikrobiol.2021., 11., 609160. [Google scholar] [CrossRef] [PubMed]
48. Belancio, V.P.; Roy-Engel, A.M.; Deininger, P. Utjecaj više mjesta spojnice u ljudskim L1 elementima. Gen2008, 411, 38–45. [Google scholar] [CrossRef] [PubMed]
49. Dai, L.; Taylor, M.S.; O’Donnell, K.A.; Boeke, J.D. Poly(A) obvezujući protein C1 neophodan je za učinkovitu L1 retrotranspoziciju i utječe na stvaranje L1 RNP-a.  Cell Biol.2012., 32., 4323.–4336. [Google scholar] [CrossRef]
50. Sluga, G.; Streva, V.A.; Derbes, R.S.; Wijetunge, M.I.; Neeland, M.; Bijela, T.B.; Belancio, V.P.; Roy-Engel, A.M.; Deininger, P.L. Put popravka nukleotida ograničava retrotranspoziciju L1. Genetika2017,205, 139–153. [Google scholar] [CrossRef]
51. Guo, H.; Chitiprolu, M.; Gagnon, D.; Meng, L.; Perez-Iratxeta, C.; Lagace, D.; Gibbings, D. Autofagy podržava genomsku stabilnost razgradnjom retrotranspozonske RNK.  Komuna.2014,5, 5276. [Google scholar] [CrossRef]
52. Xie, Y.; Prijatelji, L.; Ivics, Z.; Izsvak, Z.; Martin, S.L.; A, W. Cell divizija promiče učinkovitu retrotranspoziciju u stabilnoj L1 reporterskoj ćeliji.  DNK2013, 4, 10. [Google scholar] [CrossRef]
53. Shi, X.; Seluanov, A.; Za retrotranspoziciju L1 potrebna je gorbunova, V. Stanična podjela.  Cell Biol.2007., 27., 1264.–1270. [Google scholar] [CrossRef]
54. Goff, S.P. Faktori domaćina koje iskorištavaju retrovirusi.  Velečasni Mikrobiol2007, 5, 253–263. [Google scholar] [CrossRef]
55. Suzuki, Y.; Craigie, R. Put do kromatina – nuklearni ulazak retrovirusa.  Velečasni mikrobiol.2007., 5., 187.-196. [Google scholar] [CrossRef]
56. Shi, J.; Wang, X.; Lyu, L.; Jiang, H.; Zhu, H.J. Usporedba ekspresije proteina između ljudske jetre i linija jetrenih stanica HepG2, Hep3B i Huh7 pomoću SWATH i MRM-HR proteomike: Fokusiranje na enzime koji metaboliziraju lijekove. Droga Metab. Farmakokinet., 33., 133.–140. [Google scholar] [CrossRef] [PubMed]
57. Kubo, S.; Seleme, M.C.; Soifer, H.S.; Perez, J.L.; Moran, J.V.; Kazazian, H.H., mlađi; Kasahara, N. L1 retrotranspozicija u nepodijeljenim i primarnim ljudskim somatskim stanicama.  Natl. Acad. Sci. USA2006, 103, 8036–8041. [Google scholar] [CrossRef] [PubMed]
58. Macia, A.; Widmann, T.J.; Heras, S.R.; Ayllon, V.; Sanchez, L.; Benkaddour-Boumzaouad, dr.; Munoz-Lopez, M.; Rubio, A.; Amador-Cubero, S.; Blanco-Jimenez, E.; i sur. Projektirana retrotranspozicija LINE-1 u nepodijeljenim ljudskim neuronima. Genom Res.2017., 27., 335.–348. [Google scholar] [CrossRef] [PubMed]

(https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

https://www.mdpi.com/1467-3045/44/3/73/htm